1. 疏水作用色谱法原理
反相柱是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。
与HIC一样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
2. 疏水性色谱
TDX-01色谱柱是碳分子多孔小球的拼音缩写；具有非极性强、疏水性强、耐腐蚀、耐辐射、寿命长等特点。能够很好的分离H2、O2、CO、CO2、C1-C2等气体。
PLOT Q柱是键合聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱。极性介于Porapak-Q 和 Porapak-N 之间的PLOT 柱；是用于C1 到C3 异构体、到C12 的烷烃、CO2、甲烷、空气/CO、氧化物、硫化物和溶剂等的优异的色谱柱；取代气-固填充色谱柱的PLOT 柱； 用于分离乙烷、乙烯和乙炔（电石气）；与常规填充柱相比Q柱的更耐用,可在更短的时间内获得改进的分离度；要求的老化短时间—1 小时。
3. 疏水性相互作用色谱的原理
是指利用非极性的反相介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流动相,根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。
与HIC一样,RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
4. 疏水色谱柱原理
C18色谱柱 是一种常用的反相色谱柱，它以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，因此有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，适用范围较广，是高效液相色谱仪 分析中首选的色谱柱类型。
、由于C18柱的固定相疏水性较强，在使用过程中尽量不要使用高水相条件，若水相比例过高易引起固定相疏水塌陷，引起柱效迅速下降，甚至造成不可逆的负面影响；由于碳载量高，表现尤为明显，建议使用过程中水相比例不超过90%；
5. 疏水吸附色谱
聚酰胺分子中既有亲水基团又有亲脂基团，当用极性溶剂（如含水溶剂）作为流动相时，聚酰胺中的烷基作为非极性固定相，其色谱行为类似于反相分配色谱，因黄酮苷的极性大于苷元，所以黄酮苷比苷元容易洗脱；当用非极性流动相（如氯仿—甲醇）时，聚酰胺则作为极性固定相，其色谱行为类似于正相分配色谱。黄酮苷元的极性小于黄酮苷，因而黄酮苷元易被洗脱。此即是聚酰胺色谱的双重层析原理。
聚酰胺对极性物质的吸附作用，是由于它能和被分离物之间形成氢键所致。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间的吸附能力的大小。
6. 疏水相互作用色谱原理
常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液pH。pH小于pI时蛋白质带正电，pH大于pI时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。
离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。
亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。
如镍柱中Ni可以与His标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。
电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。
疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。
随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。
7. 疏水作用色谱法原理是什么
层析法按照原理可分为：
1、吸附层析：主要利用吸附剂对被吸附成分的吸附能力差异进行分离2、分配层析：主要利用被分离成分在两相不相混溶的溶剂中分配系数的差异进行分离3、离子交换层析：主要利用被分离成分对离子交换剂的亲和能力的不同进行分离。
4、电泳法：利用电流通过时，离子倾向性不同进行分离。
5、凝胶过滤色谱：利用凝胶对分子大小不同成分的阻滞作用不同而得到分离。
8. 疏水色谱和反相色谱原理
根据分离机理的不同，高效液相色谱可分为液-固吸附色谱、液-液分配色谱（正、反相）、离子交换色谱、离子对色谱和分子排阻色谱。1.液固色谱使用固体吸附剂，色谱柱上分离组分的原理是根据固定相对组分的不同吸附力进行分离 分离过程是吸附-解吸平衡过程。 常用的吸附剂是粒径为5-10μ m的硅胶或氧化铝 适用于分子量为200~1000的组分分离，其中大部分用于非离子化合物。离子化合物容易拖尾 它通常用于分离异构体。2.液-液相色谱使用固定相，该固定相通过在载体表面涂覆特定的液体物质或化学结合到载体表面而形成分离原理是根据分离出的组分在流动相和固定相中的不同溶解度进行分离分离过程是一个分配平衡过程。涂层固定化具有相应的良好惯性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从载体表面的损失。不同批次的温度变化和流动相差异通常会导致色谱柱发生变化。此外，流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集变得复杂。因为涂覆的固定相对于避免静止液体的损失是困难的，所以现在很少使用它目前主要采用化学键合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液相色谱法可根据固定相和流动相的极性分为正相色谱法（NPC）和反相高效液相色谱法。正相色谱极性固定相（如聚乙二醇、氨基和腈键合相）和流动相是相对非极性的疏水性溶剂（烷烃，如正己烷和环己烷）经常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃和氯仿来调节组分的保留时间常用于分离中等极性和强极性的化合物(如酚类，胺类，羰基和氨基酸等)3.反相色谱通常使用非极性固定相（如C18和C8)流动相是水或缓冲溶液。甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等水溶性有机溶剂常被加入以调节保留时间。 适用于分离非极性和极性较小的化合物 粉末冶金广泛应用于现代液相色谱据统计占高效液相色谱总应用的80％左右。随着柱填料的迅速发展反相色谱的应用逐渐扩大并已应用于一些无机或易离解样品的分析为了控制分析过程中样品的解离，通常使用缓冲溶液来控制流动相的酸碱度。 然而，应该注意的是，C18和C8所用的酸碱值通常为2.5~7.5（2~8），过高的酸碱值会溶解硅胶，过低的酸碱值会导致键合的烷基基团脱落。 据报道，新的商业塔可在1.5 ~ 10的酸碱度范围内操作。正相色谱和反相色谱对比表正相色谱反相色谱固定相极性高~中~低流动相极性低~中~高组分洗脱顺序极性小洗脱极性先大洗脱第一从上表可以看出，当极性为介质时，正相色谱与反相色谱(如氨基键合固定相)之间没有明显的边界。4.离子交换色谱固定相是一种离子交换树脂，通常是由苯乙烯和二乙烯基交联形成的聚合物骨架。羧基、磺酸基（称为阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）附着在表面末端的芳环上。色谱柱上分离组分的分离原理是树脂上的离子化离子与流动相中电荷相同的离子和被测组分的离子可逆交换，并根据每个离子的不同电荷吸引度进行分离。离子交换组。缓冲液通常用作离子交换层析的流动相分离组分在离子交换柱中的保留时间不仅与组分离子和树脂上离子交换基团之间的相互作用强度有关，还受流动相的酸碱度和离子强度的影响 酸碱度可以改变化合物的解离度，从而影响其与固定相的相互作用。 如果流动相中盐的浓度很大，离子强度将很高，这不利于样品的解离，导致样品更快流出。5.离子对色谱也称为偶离子色谱，是液-液色谱的一个分支该方法包括:根据被测组分离子和离子对试剂离子形成中性离子对化合物，增加在非极性固定相中的溶解度，从而提高中性离子对化合物的分离效果 主要用于分析离子强度高的酸碱物质。用于分析碱性物质的常用离子对试剂是烷基磺酸盐如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等此外高氯酸和三氟乙酸可以与各种碱性样品形成强离子对。四丁基季胺盐，例如四丁基胺和四丁基胺磷酸盐，通常用于酸性物质的分析。ODS柱（即C18）通常用于离子对色谱。流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3 ~ 10[/小时/]毫摩尔/升离子对试剂，在一定的酸碱度范围内分离被测组分的保留时间与离子对性质浓度流动相组成酸碱度和离子强度有关。6.排阻色谱固定相是具有一定孔径的多孔填料，流动相是能够溶解样品的溶剂 小分子量化合物可以长时间进入孔隙。大分子量化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。 它利用分子筛对不同分子量组分排斥能力的差异来完成分离通常用于分离大分子化合物如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
9. 疏水层析色谱的原理及应用
不同的氨基酸Rf值不同，层析时速度有快有慢。Rf和氨基酸的极性和疏水性有关。极性越大，疏水性越小，Rf值越小。三种氨基酸中应该是缬氨基酸的Rf最大，甘氨基酸（极性最大）的Rf最小。所以，纸层析时跑得最快的是缬氨酸，最慢的是甘氨酸。
10. 疏水色谱的原理
亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
1.抗原和抗体
利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。
例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。
将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。
另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。
2.生物素和亲和素
生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力,这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。
另外,可以利用生物素和亲和素间的高亲和力,将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用,通过生物素与亲和素的亲和力,胰岛素就被固定在琼脂糖上,可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂(如生物素与NHS生成的酯)作用结合上生物素,并且不改变其生物活性,这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。
3.维生素、激素和结合转运蛋白
通常结合蛋白含量很低,如1000升人血浆中只含有20毫克Vit -7-10-B12结合蛋白,用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力(解离常数为10 16M)而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强,所以洗脱时可能需要较强烈的条件,另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。
4.激素和受体蛋白
激素的受体蛋白属于膜蛋白,利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质,难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10 6-10? 12M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。
5.凝集素和糖蛋白
-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样,用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。a-D-甲基甘露糖苷或a-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合,可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物,就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。
如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用a-D-吡喃甘露糖苷或a凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白,几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖,因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。
6.辅酶
核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子,利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶,包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛,可以用于分离各种激酶和脱氢酶。
7.多核苷酸和核酸
利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。
8.氨基酸
固定化氨基酸是多用途的介质,通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力,或者通过氨基酸的疏水性等性质,可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L-精氨酸可以用于分离羧肽酶,L-赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。
9.染料配体
结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构,所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力,可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用,使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。
10.分离病毒、细胞
利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用,亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞,胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强,所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB,颗粒大、非特异性吸附小,适合用于细胞亲和层析。
11.金属螯合色谱
金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸(IDA)等螯合剂,它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用,生成带有多个配位基的金属螯合物,可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如Cu2+-IDA配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。
12.共价色谱
共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附,而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基-Sepharose、巯丙基-Sepharose等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上,通过适当的洗脱液如半胱氨酸,巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和,可以多次重复使用。
