1. 免疫功沉淀
串联亲和纯化(TAP/MS)是免疫共沉淀(Co-IP/MS)的“近亲”,两者在寻找诱饵蛋白的互作蛋白以及纯化互作蛋白的原理方面非常相似。但是TAP/MS经过2步亲和纯化,而Co-IP/MS只有1步亲和纯化,故而TAP/MS可以有效减少非特异蛋白的结合。
基本流程:构建含有目的基因的载体,使目的基因与2个不同的表位标签融合表达,如Flag、HA、His、CBP、SBP等等。采用Flag-HA双标签载体;载体转染细胞并表达融合蛋白“Flag-HA-诱饵蛋白”;细胞裂解提取总蛋白,经anti-flag树脂和anti-HA树脂的两步纯化和洗脱,更大限度了去除了假阳性蛋白。洗脱液进入质谱仪,分析鉴定与诱饵蛋白具有相互作用的蛋白。
2. 免疫功沉淀技术
CHIPSeq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(特异性地富集目的蛋白结合的片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的片段进行高通量测序。
研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
3. 免疫功沉淀中谁拉谁
共免疫沉淀是基于抗原抗体特异性结合的原理,体外验证两种分子之间是否存在相互作用的技术。它是免疫沉淀的延伸,其基本原理是在含有已知抗原的细胞裂解液中,将已知抗原作为靶蛋白,检测裂解液中可能存在与之有相互作用的蛋白。
加入特定的抗体以及Protein A-Beads,会形成“抗原-抗体-Protein A-Beads”的复合物。
在抗原抗体特异性结合沉淀靶蛋白的同时,存在相互作用的蛋白也能被沉淀下来,最终得到“蛋白-蛋白”的复合物。验证是否有相互作用蛋白的存在。
4. 免疫功沉淀的图怎么看
当然不能,从其定义就知道了。将抗原和抗体在琼脂凝胶孔中电泳,带负电荷的抗原向正极运动,带正电荷的抗体向负极运动,二者在琼脂凝胶中相互作用而形成沉淀线。放反的话,都跑到电泳槽中去了,溶解到buffer中了。
5. 免疫功沉淀图片分析
,凝集反应:"颗粒性"抗原与相应的抗体发生特异性结合,"在一定条件下产生肉眼可见"的凝集,称凝集反应分两类。1.直接凝集反应:如肥大氏反应、ABO血型鉴定等;2.间接凝集反应:将可溶性抗原先吸附到与免疫无关的胶乳颗粒或红细胞上再与相应的抗体结合出现肉眼可见的反应。沉淀反应:"可溶性"抗原与相应抗体结合后"形成肉眼可见"沉淀物的现象。一般在抗原抗体分子可以自由扩散的固体状琼脂凝胶中进行,抗原抗体在比例合适处结合,形成较稳定的白色沉淀线。 分以下几种:单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫比浊。免疫比浊: 在一定量的已知抗体中分别加入递增量的抗原,经一段时间反应后用浊度仪测量抗原抗体沉淀物的浊度,浊度与抗原浓度呈正比。沉淀线的应用,一般是用单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳试验中,抗原抗体结合的一个重要特点是,特异性按比例,当抗原抗体比例合适的时候,就会在我们使用的琼脂板上形成肉眼可见的清晰的沉淀线,一般用作一些如补体、免疫球蛋白、还有某些肿瘤因子的的检测。
6. 免疫共沉淀
1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
2. 防止非特异性的RNA的结合。
3. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
4.结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
延伸阅读:95%的人类基因组并不编码基因,而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用,与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关,并且参与着干细胞和表观遗传学调控。
7. roche 免疫共沉淀
瑞特(Wright)染色法:为发观察细胞内部结构,识别各种细胞及其异常变化,血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。
(1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐,即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后,产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀,即瑞特染料。
(2)细胞的染色既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用,各种细胞成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。因此,用本染料液染色后,在同一血片上,可以看到各种不同的色彩,例如血红蛋白,嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结果,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染紫蓝色,称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染淡紫色,称为中性物质。
(3)PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,所带电荷随溶液PH而定,在偏酸性环境中下在电荷增多,易与伊红结合,染色偏红;在偏三性环境中负电荷增多,医学|教育网搜集整理易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感,染色用正经片必须清洁,无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇,稀释染色必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则可导致各种细胞染色反应异常,以致识别困难,甚至造成错误。