水分不仅是食用菌细胞的重要成分，而且养料的吸收及运输、代谢废料排泄等离开水都无法进行。因此，食用菌在生长发育的各个阶段，都必须供给充足的水分。食用菌生长发育所需要的水分绝大多数来自培养料。培养料含有充足的水分，是菌丝体生长及子实体大量形成必不可少的因素。食用菌菌丝生长阶段，培养料的适宜含水量一般为60％~65％，子实体形成阶段需水量更大。培养料中的水分由于蒸发及子实体吸收而不断减少，因此，栽培时需经常喷水。此外，菇房中如能经常保持一定的空气相对湿度，也能防止培养料中水分的过度蒸发。除培养料应有充足的水分，食用菌还需要一定的空气相对湿度，适宜菌丝体生长的空气相对湿度，一般以80％~95％较为适宜。当空气相对湿度低于60％时，平菇等食用菌的子实体停止生长；当空气相对湿度低于45％时，子实体不再分化，已分化幼菇会干枯死亡。
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