清咸丰三年（1853年）3月29日，太平军占领南京，定都天京，建立太平天国政权。暂住藩习衙署，不久后开始修缮两江总督署，5月开始在原两江总督署的基础上修建天王宫（今天王府），随即以原两江总督署为中心，扩建为天王府。至11月，不慎失火，夷为平地。
清咸丰四年（1854年）2月，天京天王宫再次破土动工。
清同治三年（1864年）6月1日，幼天王洪天贵福继位。7月19日天京失守，随后清军屠城，湘军攻破天京后太平军放火烧城，湘军在大肆抢劫后也到处纵火，焚毁宫殿建筑。
清同治九年（1870年）重建两江总督署。林则徐、曾国藩、李鸿章、刘坤一、沈葆桢、左宗棠、张之洞、端方等均任过两江总督。
清宣统三年（1911年）10月辛亥革命爆发，江浙联军克复南京，遂议决南京为临时政府所在地。
民国元年（1912年）1月1日，孙中山先生在此处宣誓就任中华民国临时大总统，并组建中华民国，定1912年为民国元年，并成立中华民国临时政府。同年4月，临时政府结束，在这里成立了以黄兴为留守的南京留守府。
民国二年（1913年）“二次革命”中，成为讨袁军总司令部，黄兴、何海鸣先后任司令。
民国二年至民国十六年（1913年至1927年），这里先后成为江苏都督府、江苏督军署、江苏将军府、江苏督办公署、副总统府、宣抚使署、五省联军总司令部、直鲁联军联合办事处等机构。军政主官有程德全、张勋、李纯、齐燮元、卢永祥、冯国璋、孙传芳、杨宇霆、张宗昌等人。
民国十六年（1927年）4月南京国民政府成立后不久，即于9月移驻这里办公。
民国十七年（1928年）10月，国民政府实行五院制，辟国民政府东院（东花园）为行政院办公处，国府西院（西花园）为国民政府参谋本部和主计处。至1937年11月，谭延闿、蒋介石、林森先后任国民政府主席；谭延闿、宋子文、蒋介石、陈铭枢（代理）、孙科、汪精卫先后任行政院长；李济深、何应钦、朱培德、蒋介石、程潜先后任总参谋长；陈其采为主计长。
民国二十七年（1938年）3月28日，梁鸿志等人在南京成立日本傀儡政权中华民国维新政府。
民国二十九年（1940年）3月，维新政府和另一傀儡政权中华民国临时政府并入汪精卫南京国民政府。汪伪政权的正式成立，表明汪精卫集团完全沦为日本侵华的工具。国民政府先后成为日军第16师团部和伪维新政府行政院，以及汪伪政府的立法院、监察院和考试院；国府东院成为伪交通部、铁道部等机构；国府西院成为伪军事参议院。
民国三十五年（1946年）5月，国民政府还都南京后，仍为国民政府所在地。东花园成为国民政府社会部、地政部、水利部和侨务委员会；西花园则成为国民政府主计处、军令部，总统府军务局、首都卫戍总司令部。
民国三十七年（1948年）5月20日，蒋介石、李宗仁在行宪国大分别当选总统和副总统后，国民政府改称总统府。
1949年4月23日，中国人民解放军解放南京，24日凌晨攻占总统府，南京解放。南京解放后，总统府一直作为机关办公场所。
1982年2月，南京总统府以太平天国天王府名义列为全国重点文物保护单位。自20世纪80年代以来，机关单位陆续搬迁，并于1998年在总统府旧址之上，开始筹建中国近代史博物馆。
2002年9月3日，南京市旧城改造过程中，总统府大照壁于零时30分遭到拆除，拆下来的部件加以保存，并承诺日后重建。
2003年3月，中国近代史博物馆建设工作完成，并正式对外开放。
2004年，南京总统府被评为国家AAAA级旅游景区。
2013年1月，南京总统府门楼保护性修缮工作取得阶段性成果，历时2个多月的外立面修缮基本完成，门楼为1932年的外观进行保护性修缮。
