1. 生物素和链霉亲和素
DAB显色液配制
10mM Tris-HCl (pH7.6) 9mL +DAB (diaminobezidin 3,3-二氨基联苯胺) +0.3%(W/V) NiCl2 或CoCl2 1mL ,显色时加入5-10mL 30%H2O2 混匀后立即使用
按此比例配置,不需要稀释。
显色
准备好含有待测蛋白的固相膜:包括电泳、转印、封阻、一抗(或生物素)处理、辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(或链霉亲和素)处理、清洗等步骤。
2. 生物素和链霉亲和素热洗脱
针对外显子序列设计捕获探针,与外显子DNA序列相互补。
探针上标记有生物素。
基因组DNA进行超声打断,与捕获探针杂交。
利用探针上生物素与带有链霉亲和素的磁珠结合,通过富集磁珠间接地获得全外显子测序文库。回答完毕了好好好好好
3. 生物素和链霉亲和素结合条件
将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中,加入无关蛋白载体封闭未结合位点,加入标准品(样本)和生物素标记的抗原物质进行竞争结合,经合适的温度和一定时间的孵育,洗涤后,加入HRP标记的链霉亲和素进行反应,TMB显色,微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
4. 生物素和链霉亲和素结合后保存缓冲液有要求吗
猫咪不可以吃生的蛋清,主要有以下几点原因:
第一、猫咪胃肠道较脆弱,吃了生的蛋清可能会引起猫咪出现呕吐、腹泻的症状。
第二、生的蛋清可能含有寄生虫或其他病原体,猫咪食入后可能会感染寄生虫或其他疾病。因此如果想给猫咪吃鸡蛋最好煮熟后再喂食。
养猫猫注意事项
刚领进门的猫咪要注意:千万不要先给它洗澡。应激会造成猫咪免疫力下降,易感染疾病。最好不要换粮,寄予纯净水。一定要为猫咪准备充足的水,促进猫咪多饮水。
5. 生物素和链霉亲和素结合时间
SA为 略偏酸性的蛋白。SA的每条肽链含159个氨基酸残基,其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比一般亲合素少,反之含酸性氨基酸较多,其等点为6.0,较A(pI=10)为低,同时在结构中SA不含任何糖基,而A含糖可高达10%。
SA分子量为65000,由4条序列相同的肽链构成,每条SA肽链可以结合1个生物素分子。因此与A一样,每个SA分子也具有4个可与生物素分子结合位点,其结合常数与A相同为1015mol/L。约为抗原抗体间ka(105~1011 mol/L)的1万倍以上。
6. 生物素和链霉亲和素反应原理
生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应,并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域,既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究,亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
生物素广泛分布于动、植物组织中,常从含量较高的 卵黄(α型)和肝组织(β型),提取αβ两型的生物活性基本相同,现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应,故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31,分子中有两个环状结构,其中I环为咪唑酮环,是与亲合素结合的主要部位;II环为噻唑环,上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。
利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物,称为活化生物素,以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用。近年来,应用活化长臂生物素(BCNHS)标记生物大分子,可以减少位阻效应,增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(BHZ)及肼化生物素(BCHZ)。
探针是一小段单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp),用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链,随后用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中,而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。
当将探针与样品杂交时,探针和与其互补的核酸(DNA或RNA)序列通过氢键紧密相连,随后,未被杂交的多余探针被洗去。最后,根据探针的标记物种类,可进行放射自显影、荧光发光、酶联化学发光等方法来判断样品中是否,或者何位置含有被测序列(即与探针互补的序列)。