木质素的微生物降解

木质素是植物的主要成分之一，占植物细胞化学组成的15%～30%。在植物体中，木质素是包裹在纤维素的外面，功能之一就是保护植物细胞不受外界微生物的侵蚀。从生物合成过程研究得知，木质素首先是由葡萄糖发生芳环化反应形成莽草酸(Shikirnic acid)，然后由莽草酸合成三种具有苯丙烷结构的基本单元，分别为：对香豆醇、松柏醇、芥子醇。从化学结构看，针叶树的木质素主要由松柏醇的脱氢聚合物构成愈创木基木质素；阔叶树的木质素由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈创木基—紫丁香基木质素；草本植物则由松柏醇、芥子醇和对香豆醇的脱氢聚合物和对香豆酸组成。木质素是结构复杂、稳定、多样的无定形三维体型大分子，在自然界中，降解缓慢，成为地球生物圈中碳循环的障碍。 1木质素微生物降解酶系及酶活性调控 自然界参与降解木质素的微生物的种类有真菌、放线菌和细菌。其中，真菌能把木质素彻底降解为CO2 和水。 降解木质素的真菌主要分为三类：白腐菌、褐腐菌和软腐菌。白腐菌在木质素的生物降解中占有十分重要的地位。白腐菌多数是担子菌(Basidiomycetes，少数为子囊菌。黄孢原毛平革菌是研究最多的木质素降解菌。Tien和Glenn 两个研究小组几乎同时发现木质素被降解的关键是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)产生的胞外木质素过氧化物酶系的作用。该酶系包括木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称Lip)、锰过氧化物酶(Mn-dependent peroxidase，简称MnP)，除此之外，还有虫漆酶、HRP、CDH 等酶类。云芝(Corilus versicolor)是一种非常重要的白腐菌，对木质素的降解能力较强。丁少军等 研究了云芝漆酶的培养和分离纯化研究，发现在云芝的木质素降解过程中，漆酶活力较高而木素过氧化物酶、锰过氧化物酶活力较低，它们对木质素的降解率比黄孢原毛平革菌提高近一倍，并认为漆酶在云芝的木质素降解过程中起非常重要的作用。林鹿等研究了白腐菌木云芝和黄孢原毛平革菌对制浆黑液中硫酸盐木质素的降解作用和影响因素。他们发现分子量在1 500～3 000 kD 之间的硫酸盐木质素降解最为显著；两种白腐菌的降解能力不同，培养10 天后，木云芝Lu-11 的降解率达74.5%，降解产物只有一种主要组分，而黄孢原毛平革菌的降解率为65.6%，降解产物有两种，培养条件如：碳源、氮源、pH 值、温度对白腐菌降解硫酸盐木质素的作用有明显影响；在白腐真菌胞内中，除含有利用H2O2 的过氧化物酶系外，还分泌利用O2 的多酚氧化酶系，主要为漆酶(laccase)，该酶需要依赖氧和助剂的存在才能有明显的脱甲氧基和脱木质素作用。Andrzej综述了漆酶在木质素降解的作用与活性，认为虫漆酶在木质素降解中起非常关键的作用。付时雨等[8，9] 用漆酶/助剂通入氧气处理苇浆残余木素，通过甲氧基的测定、元素分析、13C-NMR、IR 分析苇浆残余木素与漆酶/助剂反应前后结构的变化，研究发现苇浆残余木素在反应后甲氧基、酚羟基减少，醇羟基增多，木素结构中羧基增多，木素的苯环结构发生了开环反应。除上述酶类外，白腐菌还产生胞内H2O2 产生酶，因胞内还有过氧化物水解酶，因此胞内不会积累；纤维二糖脱氢酶和纤维二糖/醌还原酶系(CBQ)也是白腐菌产生的重要的木素降解酶。黄峰等[11，12] 报道用裂褶菌(Schizophllum commune)所产的纤维二糖脱氢酶(CDH)加入在黄胞原毛平革菌锰过氧化物酶解硫酸盐浆木质素，结果发现木质素溶出物质明显增加；木质素中甲氧基、羧基、酚羟基和总羟基含量减少，CDH 促进了锰过氧化物酶(MnP)的降解作用。表明CDH 不仅能促进纤维素的降解，而且也是木质素降解体系中的重要组成部分。纤维二糖/醌还原酶(CBQ)是1974 年由Westermark 和Erikssion 发现的。木质素在氧化酶作用下转变为芳环自由基和醌类，CBQ 能防止活性中间体再聚合，将醌还原为氢醌，CBQ 在纤维素和木素降解中起到了协同作用，即纤维素降解产物为木质素的降解提供还原力。谢君等利用白腐侧耳菌(P.sp2)和粗毛栓菌(T.gallica )在含有麦草的液体培养基中生产木质纤维素降解酶的研究，发现侧耳sp2 和粗毛栓菌在液体培养基中产木质纤维素酶类的能力强、产酶较快，且首先降解木质素，侧耳菌和粗毛栓菌比较，粗毛栓菌(T. gallica )具有更强的分解麦草木质素的能力，60 天后麦草中70.14%的木质素被降解。 不同的生理条件对微生物降解木质素的重要影响成为木质素微生物降解研究的一个热点问题[15，16]，王宜磊研究了碳源与氮源对彩绒革盖菌Coridus versicolor 木质素酶分泌的影响，发现淀粉含量丰富的物质作碳源有利于木质素降解酶的分泌，而尿素对木质素降解酶的分泌有抑制作用，具体原因有待于进一步研究；王佳玲等[18，19] 研究了氮源、碳源及Mn2+ 浓度对Panus conchatus 分泌木质素降解酶的影响，认为高氮条件可能是这种类型的白腐菌生产木素降解酶的重要条件，同时发现紫丁香醛和香豆酸对其锰过氧化物酶和漆酶分别起显著的诱导作用，碳源的种类对MnP 和漆酶(laccase)产生的影响有明显的差异，Mn2+对P.conchatus MnP 和laccase 的产生有明显的调节作用：不加Mn2+条件下，P. conchatus 几乎不分泌MnP，加入Mn2+并提高Mn2+浓度，MnP 活力随之提高，而laccase 活力却相应降低。余惠生等研究了铜(Ⅱ)离子浓度的变化对白腐菌Panus conchatus 产漆酶的影响，结果表明漆酶的产生显著受Cu2+的调控，没有铜离子存在，漆酶的活性很低，增加Cu2+浓度，漆酶的活性增大，但过多的Cu2+又会对漆酶产生抑制作用，使酶活降低。 2 木质素生物降解机制 (1)木质素模型化合物的Ca-Cb断裂现已基本确定，通过单电子转移机制，LiP 催化氧化b-1 非酚型木质素模型化合物为其芳香正离子自由基，经Ca-Cb断裂形成3，4-二甲氧基苯乙醇自由基和质子化形式的藜芦醛。有氧存在时，前者加氧后再释放超氧离子形式羰基，或形成醇，无氧存在时则溶剂水参与而形成醇。付时雨等利用色—质联用技术分析了稻草木质素经白腐菌Panus conchatus 生物作用后木质素降解产物中低分子酸性组分的主要变化及其结构，通过质谱对其主要11 种化合物结构进行分析，证实木质素生物降解过程发生木质素侧链Ca-Cb链氧化断裂。 (2)Ca-氧化机制 LiP 催化b-O-4 木质素模型化合物的主要反应是Ca-Cb断裂形成的藜芦醛和2-甲氧基苯酚，后者在反应条件下易于聚合，同时还有相当一部分形成Ca氧化产物。这种氧化产物是正离子自由基中间体失去质子或直接失去氢形成的。在活性氧存在时，后者更容易发生。 (3)芳环取代机制在催化反应中形成的芳香正离子自由基与溶剂水或其他亲和试剂作用，随底物的不同而发生不同类型的反应，例如，当苯环上的取代基是甲氧基时，就发生脱甲氧基反应，氧化形成相应的醌。 (4)氧的活化在木质素模型化合物氧化中一种普遍现象是分子氧与羟基取代的苯自由基间的反应中能引起氧的活化，氧被还原成超氧离子，又与氢质子反应生成H2O2 与O2，这个过程是发生在分子氧与苯基中间体之间的纯化学过程。这个反应也出现在木质素过氧化物酶的催化循环中，其结果是O2 成为最终的电子受体。 (5)藜芦醇及其衍生物的氧化藜芦醇是黄孢原毛平革菌的一个次级代谢产物，又被木质素过氧化物酶所分解，分解产物主要是藜芦醛，其次是开环产物和醌，产物的分布受pH 值控制。 (6)芳香环开裂利用标记底物和反应物的方法对许多模型化合物进行芳香环的开裂反应研究表明，藜芦醇开环反应的机制也适用于木质素单体、二聚体和低聚体模型化合物，在大多数请况下都得到了多种产物的混合物。 (7)单甲氧基芳香物的氧化对于3，4-二甲氧基芳香环，非但可被Phanerochaete chrysosporium 代谢，而且可被LiP 氧化，单甲氧基芳香环虽然可被Phanerochaete chrysosporium 代谢，却不被LiP 氧化，然而加入少量的藜芦醇或其他的二甲氧基芳香物，则能大大提高单甲氧基芳香物的反应速度。 (8)醌/氢醌的形成漆酶是一种含铜的酚氧化酶，它能催化酚型二聚体模型物b-1 和b-O-4 结构经过Ca-芳烃断裂，产生甲氧基取代的醌/氢醌。辣根过氧化物酶(HRP)也能得到类似的结果。单体木质素模型物如香草酸、香草醛、香草醇等也能被氧化成甲氧基取代的醌/氢醌。余惠生等用定量13C-NMR 技术研究了稻草经白腐菌Panus conchatus 降解后木质素的高分子部分的结构特征变化，发现发酵稻草木质素的13C-NMR 图谱出现新的吸收峰以及某些吸收峰的强度有明显变化，这些变化证实了在生物作用过程中木质素大分子中形成了醌类。 (9)漆酶催化木质素氧化的机制漆酶以O2 作电子受体催化多酚化物经四次单电子传递形成醌及自由基的含铜的酚氧化酶，而且不需要H2O2 参与，对于木质素而言，其反应包括脱甲氧基、脱羟基、C-C 键断裂过程等。 3 木质素微生物降解的意义 木质素是自然界可再生的含量丰富的天然高分子聚合物，也是化学制浆工业中重要的废弃物和污染物。 (1)应用于污染治理与环境保护传统的化学制浆会带来大量的工业废水，污染环境，将木质素的生物降解应用于生物制浆及造纸废水的处理，不仅可以极大地改善造纸工业的环境污染问题，还有利于减少能耗创造经济价值。Gary Ward利用木素过氧化物酶处理2，4二溴苯酚等工业废水，在氧化的过程中伴随二聚体、三聚体和四聚体的形成，消除了废水的毒性。我国的纺织业和印染业非常发达，印染废水的污染成为水污染的一个重要来源，陈叶福等综述了木质素生物降解与纸浆工业废水脱色，认为白腐真菌能降解木质素和相关化合物，有可能成为传统处理方法的替代方法。据文献报道，黄孢原毛平革菌在产酶条件下可以降解偶氮染料、蒽醌染料以及三苯甲烷等多种类型的染料。张朝晖等[26，27] 研究了黄孢原毛平革菌所产木质素过氧化物酶系对染料降解的研究，建立了木质素过氧化物酶降解偶氮染料卡布龙红的动力及过程模型。 (2)应用于造纸工业木素酶的生物漂白技术是通过生物木素酶直接作用于纸浆的残余木质素，并使之发生降解溶出，从而有利于纸浆的进一步漂白。林鹿等研究了降解木素酶和降解木聚糖酶对硫酸盐浆的生物漂白及机理，结果显示，木素酶降低了纸浆的卡伯值，提高了纸浆的白度。 (3)应用于化工产品木质素微生物降解有可能使其转化为重要的化工产品、微生物蛋白饲料或有机肥料，使其变废为宝。例如，用木质素降解菌处理饲料，可提高动物对饲料的消化率。目前，以木素酶、纤维素酶和植酸酶等组成的饲料复合多酶添加剂已达到商品化程度。当然，木质素的生物降解研究与应用最活跃的领域是生物制浆、工业废水的处理，而应用于食品与发酵工业、饲料工业已经显现出诱人的前景。 4 结语 木质素是第二大可再生天然高聚合物，结构复杂，降解缓慢。研究木质素的降解对促进资源的高效利用、减轻环境污染有极其重要的意义。目前木质素的降解研究主要集中在木质素的生物降解机制、微生物种类及其产生的相关酶类、微生物的代谢调控机理等方面；在木质素降解酶系的协同作用机理、降解菌酶系的高效基因表达与调控方面研究成果还较少。通过人工诱变、基因重组、克隆技术筛选出特效高酶活降解菌，大规模应用于生物制浆、纸浆的酶法漂白、工业有机废水的高效处理应成为木质素微生物降解研究的热点领域。