反转录步骤及其作用 | 反转录pcr原理和步骤

1. 反转录pcr原理和步骤

1、核酸的基础研究：基因组克隆

2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序

3、反向PCR测定未知DNA区域

4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA

5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控

6、cDNA末端快速扩增技术

7、检测基因的表达

8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学

2. 逆转录pcr原理和步骤

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.

3. 反向pcr和反转录pcr

其实一步法并非是两步法的改进，根据实验目的不同，有时两步法会更好。

举个例子，如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因，那么一步法是从RNA开始的，即分别取相同量的RNA，然后逆转录，然后加入不同的primer PCR，方法固然简单，但逆转录酶很贵。如果两步法，可将RNA逆转录为cDNA，然后每次加入相同量的cDNA，再加不同的引物PCR，这样可比性强，而且不需逆转录，直接PCR即可。当然，如果想快速获得某一种基因，当然一步法好。所以一步法和两步法各有优点，不能一概而论。

4. 一步法反转录pcr

原因可能有以下三点，

1.移液量可能不一致。

2.做不好的原因的RNA的降解，当然也就是RNA完整性的问题，RNA的完整性，一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上，如果这两个条带的RNA亮度变低，甚至没有，就说明RNA的完整性应该会有损失。

3.也是相对来说比较难解决的，就是抑制物，在反转录过程中或者PCR过程中都可能有抑制物，这些抑制物，比如Na离子，EDTA，SDS，酚，血红素，腐植酸等等，都会对qPCR结果产生影响。

5. 反转录pcr程序

逆转录是不需要上下游引物的，可以选择随机引物，也可以用oligo引物，这些都是反转录试剂盒里带的。

6. 反转录pcr的程序

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1

、ARBP内参基因等。

正向引物（上游引物）是沿着负链进行不间断延长的反向引物（下游引物）是沿着正链进行一段段延长的正链是含有目的基因的那条链。

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

7. 做反转录pcr的目的

几种重要的PCR衍生技术

（一）逆转录

PCR技术逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。

RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。

（二）原位

PCR技术原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。

（三）实时

PCR技术实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。

8. 反转录pcr的原理

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。　　RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。　　RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。　　 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

9. 反转录pcr程序温度

甘油能降低高G+C区域的二级结构，能促进长距离PCR和提高标准PCR方法的反应专一性。此外，有报导在多重PCR(O.Henegariu等，Biotechniques，1997，23504)和等位专一PCR(R.S.Cha等，PCR Methods and Applications，1992，214)反应液中添加甘油。上述研究有二个共同特点，

第一，甘油浓度较低通常为5-10％(V/V，下文中未指明的均指体积百分比)，文献报导的最高浓度为20％(Y.H.Liu等，Trends in Gentics，1993和S.Vilcek，Journal Virological Methods，1993，41245)

第二，添加甘油后变性温度包括首次和循环变性均仍采用常规的94或95℃。尚未有文献或专利将甘油浓度扩展至20-45％，并且将含5-45％甘油的PCR反应的首次变性温度提高到大于95℃至98℃，循环变性温度降低到小于94℃至60℃的报道。

在一管法RT-PC方面，至今仅有一篇文献(T.W.Myers等，PCR Strategies，p.58-68，Ed.M.A.Innis等，1995)在反应液中添加3％甘油，加上原来由DNA聚合酶和反转录酶试剂带进的2％甘油，使PCR能在含5％甘油反应液中进行。未有将一管法RT-PCR反应液的甘油浓度扩展至5-25％的报道。