1. 保护碱基的作用
设计引物时在2引物的5‘端添加酶切位点和保护碱基，保护碱基根据限制性内切酶的不同而不同，可查资料选择。
2. 保护性碱基的作用
DNA合成，新链的延伸方向是5→3 因此，需要在5端加上酶切位点 酶切位点可以上网查 同时，记得再加上一些保护碱基 因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来 保护碱基的具体数目可以上NEB的网站查 那么，引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
3. 引物保护碱基的作用
PCR技术的原理是利用碱基互补配对的原则，把体内基因的复制在体外进行，从而得到大量的目的基因。主要原理如下：双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）合成新的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要一小段双链DNA来启动“引导”新链的合成，因此新合成的DNA链的起点事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA两端的退火位点决定的。在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链DNA都可以作为合成新生互补链的模板，因为在PCR反应中所选用的一对引物是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反(5’→3’方向)方向延伸。如此变性、复性、延伸三个过程反复循环，产生了目的片断的大量克隆。
PCR技术是模仿体内的条件，使基因扩增，所以在扩增体系中需要有DNA聚合酶、一定的pH值的缓冲液、要扩增的目的基因（模板），起始扩增的DNA目的片断的引物，及扩增需要的原料（四种三磷酸脱氧核糖核苷酸），Mg2+,DNA复性、变性及延伸温度与时间等。
4. 添加保护碱基的注意事项
如果要加在序列的5'端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5'端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3'端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3'端加上相应的碱基（黑色），切割率：正确识别并酶切的效率。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
5. 保护碱基的作用是什么
在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
6. 保护碱基加在哪边
我们采用固相亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，它 具有高效、快速的偶联以及起始反应物稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的核苷酸通过 3' → 5' 磷酸二酯键连接，具体反应步骤如下： 第一步：将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5'- 羟基。 第二步：亚磷酰胺保护的核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3' 端被活化，与 CPG 载体上连接碱基的 5'- 羟基发生缩合反应。 第三步：带帽 (capping) 反应，缩合反应中会有少量 5'- 羟基没有参加反应，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑封闭 5'- 羟基，使其不能再继续发生反应，这种短片段在纯化时可以分离去除。 第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
7. 保护碱基添加原则
单磷酸腺苷（英文：Adenosine monophosphate，简称AMP），又名一磷酸腺苷，5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸，是一种在核糖核酸（RNA）中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸盐官能团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。一磷酸腺苷是由ATP两次水解得到的。一个碱基加一个五碳糖。
8. 保护碱基的作用机理
亚硝酸是常用的脱氨基诱变剂，其作用机理主要是脱去碱基分子中的氨基使腺嘌呤（A）脱去氨基变成次黄嘌呤（H）、胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤（X）。
胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。
腺嘌呤脱去氨基变成次黄呤后，其b位C原子部分变为酮基不能按原来的配对原则与胸腺嘧啶（T）相联，因为T的b位C原子上也是酮基，而只能与b位C原子是氨基的胞嘧啶（C）配对。
同理，胞嘧啶脱去氨基转变为尿嘧啶，不能与鸟嘌呤配对，只能与腺嘌呤配对。便造成AT→HC→GC和GC→UA→TA碱基对的转换，从而引起遗传信息的错误而造成突变。
9. 碱基对的作用
DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。脱氧核糖核酸（DNA）是生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。碱基对是一对相互匹配的碱基（即A—T， G—C，A—U相互作用）被氢键连接起来。然而，它常被用来衡量DNA和RNA的长度（尽管RNA是单链）。它还与核苷酸互换使用，尽管后者是由一个五碳糖、磷酸和一个碱基组成。碱基对是形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。组成碱基对的碱基包括A、G、T、C、U。严格地说，碱基对是一对相互匹配的碱基(即A：T，G：C，A：U相互作用)被氢键连接起来。然而，它常被用来衡量DNA和RNA的长度(尽管RNA是单链)。它还与核苷酸互换使用，尽管后者是由一个五碳糖、磷酸和一个碱基组成。
