1. 蛋白酶k通用吗
一、实验原理
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂
1. 仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2. 试剂：
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
四、常见问题
1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。
2. 蛋白酶 k
血痕的DNA分析目前已成为常规技术，技术的关键在于DNA的提取及定量。有机溶剂法提取的DNA纯度较高，基本提取步骤为：剪碎血痕，置于1.5ml离心管中，加400 μ l提取缓冲液（10mmol／LTris，10mmol／LEDTA，10mmol／L Na Cl，39mmol／L DTT，2%SDS）及10 μ l蛋白酶K（20mg／ml），56℃过夜。血痕及其他法医物证检材中常有杂质存在，可抑制PCR扩增。
使用时用特制打孔器截取直径约1.2mm的血痕置于塑料试管中，用FTA纯化缓冲液洗涤三次，TE漂洗两次
3. 蛋白酶K是什么
1.
一次运行可实现96个样本管的自动开盖、样本转移和关盖，实现检验人员与样本的“0”接触，降低感染的风险。
2.
可自动实现10混1的混样功能，轻松实现混样检测，无需再购置专用混样平台。
3.
可完成蛋白酶K和外源性内标的添加工作，分样后的96孔板无缝对接后续的提取和检测工作。
4.
全程自动化，同时使用智能图像识别技术，具备预警功能，能够进一步降低出错的可能。
4. 蛋白酶k通用吗知乎
纤维提取技术如下
A1）秸秆经去杂、除尘、揉丝、切段、清洗后置入汽爆分离器中，加入秸秆质量1-20倍的水，加入碱至碱液质量浓度为5-25%，向汽爆分离器中通入水蒸汽至温度升至60-95℃后，停止通水蒸汽；向汽爆分离器中通入惰性气体，将汽爆分离器内空气排净，封口；然后间歇性向汽爆分离器内通入水蒸汽以及惰性气体，以维持汽爆分离器内温度为80-110℃、压力为0.5-2MPa，保温保压20-180分钟后喷放；
A2）将喷放浆状物移至研磨磨中研磨，研磨完毕后，过30-50目筛，筛除浆液中的短小纤维；
A3）固液分离，得滤渣一和滤液一；
A4）滤渣一采用稀热碱溶液洗涤若干次，固液分离，得滤渣二和滤液二；
A5）将滤渣二置于酶解罐中，加入滤渣二1-10倍质量的水，并加入复合蛋白酶，酶解10-80分钟；随后加入常温型α-淀粉酶，酶解10-80分钟；然后通入蒸汽升温至60-70℃，保温2-20分钟，灭活酶的活性；所述复合蛋白酶由具备内肽酶活性的碱性蛋白酶和具备端肽酶活性的蛋白酶K组成；所述常温型α-淀粉酶由微波诱导所得变异地衣芽孢杆菌分泌所得α-淀粉酶，所述常温型α-淀粉酶的适宜温度为22-35℃；
A6）将酶解罐中的混合物置于漂白罐中，加入双氧水至双氧水的质量分数为0.1%-0.5%，于50-80℃下保温10-120分钟；
A7）继续加入双氧水，至双氧水的质量分数为2%-5%，进行漂白处理；
A8）固液分离，得滤渣三和滤液三；滤渣三经过醇洗和水洗后，得滤渣四；
A9）滤渣四经干燥、粉碎，即得纤维浆粕成品。
5. 蛋白酶K是蛋白质吗?
模板DNA浓度主要看你的PCR扩增体系所使用的酶： 1、一般普通的酶，DNA模板量在50到100ng都可以扩增出来的 2、高效一点的酶，几ng也可以扩增出来的。
1、PCR反应步骤：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 2、PCR反应五要素：①引物（Primer）、②酶 （Taq DNA Polymerase） 、③dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP）、④模板（Template）、⑤Mg2+（Magnesium） 3、引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 4、酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。5、模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。6、PCR扩增条件包括温度、时间和循环次数。
