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薄层层析

又称薄层色谱。是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属片等)上,形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后,在此薄层上进行层析分离的分析方法。

分析程序

将样品溶液用毛细管点在薄层板的一端,置密闭槽中,加入适宜溶剂为流动相。由于毛细管作用,溶剂被吸上,沿板移动,并带动样品中各组分向前移动,这个过程称为展开。由于各组分性质不同,移动距离不同,展开一定距离后,即得互相分离的组分斑点。可用适当方法使各组分在板上显示其位置,如组分本身有颜色,即可直接观察,否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光等办法确定斑点位置。通常用比移值(Rf)表示组分移动的特性,其定义为:

公式 符号

在流动相、固定相和展开条件固定时,Rf值是组分的特性,可用以进行定性鉴别。实用时也常将样品与已知纯物质同时展开,比较二者移动情况,进行定性分析。

定量方法

可分为洗脱测定法和原位扫描法:

(1)洗脱测定法,将展开后的组分斑点处的吸附剂刮下,用适宜溶剂将组分洗脱溶出,然后用适当方法进行定量测定。常用方法为比色法、紫外-可见分光光度法,也可用电化学分析法等。

(2)原位扫描法,将展开后的薄层板放在光密度计内,以一定波长的光照射,同时使斑点移过光路,由于斑点对光的吸收,可绘出峰形曲线,由峰面积与标准样品的吸收相比较而求出含量。

薄层层析法以吸附层析使用最为普遍。常用的吸附剂为硅胶、氧化铝等。薄层层析和其他层析法一样,除吸附法外,也可进行分配、离子交换、分子排阻等机理的层析,即将铺制薄层的材料相应换为涂以固定相的载体、离子交换剂、凝胶等,其操作与吸附法基本相同。

制板

铺制薄层板时,要求基底板洁净平整,可用干法或湿法铺制。现常用湿法制板,即将吸附剂和粘合剂(如烧石膏)按一定比例混合,加入适量水调匀,用涂布器将此匀浆缓慢地移过基底板,放置晾干,再经适当烘烤活化后即可使用。如不加粘合剂和水,直接将吸附剂均匀地铺成薄层,则为干法制板。现在市场上已有各种制好的薄层板出售,统称预制板。

展开

有多种方式,以上行法最为常用。将薄层板垂直或倾斜放置,将展开溶剂加于低部,使之自下向上移动。下行法则为用滤纸将溶剂引至薄层上端,使其自上向下流动。平行展开时,将板平放,溶剂被吸上至薄层板点有样品的一端,进行展开。使用圆形薄层板时,将样品点在圆心附近,使溶剂自圆心向圆周方向移动,称为环形展开或径向展开;将样品点在圆周位置,使溶剂自圆周向圆心移动的为向心展开,适用于Rf值大的组分的分离。将点样品处附近的吸附剂刮去,使溶剂只能通过样品点附近的较窄部分前进展开,因而溶剂前缘呈弧形的展开方式,也称径向展开,这种方式对较难分离的组分可能效果好些。

展开一次后取出薄层板使溶剂挥发,再用同一溶剂或换用其他溶剂再次沿此方向展开的称多次展开。将样品点在方形薄层板的一角,先沿着一个方向展开,然后将板转动90°,再沿着另一方向展开的为双向展开。多次展开和双向展开都可加强分离效果。

特点

操作简便,设备简单,除光密度计外,不需特殊设备,分离效果较好,时间较短,一块板上可同时分离许多样品。除低沸点物质外,各种无机和有机化合物都可进行分离。

应用和发展

广泛应用于石油、化工、医药、生化等方面。样品用量一般为几至几百微克,是一种较实用、有效的微量分离分析方法。此法也可用于分离制备较大量的样品,即使用较大较厚的薄层板,将样品溶液在起始点处点成条带状,这样可以分离毫克量样品。

高效液相色谱法是用微细颗粒得到高效分离的办法,也已用于薄层层析。使用5~10微米的吸附剂制板,可得较好的分离效果,为与一般的薄层层析法相区别,称为高效薄层层析。其优点是样品量少(只需纳克量样品)、展开距离小、展开时间短,是薄层层析法的一个重要发展。